P.305 传染病病原9~14

九、致病性链球菌-G+、甲乙型溶血性、丙型;ABCD等20群Lancefield分群

  • 非侵袭性(即浅表性)感染:咽炎、脓疱病、丹毒、阴道炎
  • 侵袭性感染:菌血症、蜂窝织炎、新生儿败血症、心包炎、脑膜炎
  • 毒素相关:猩红热、毒素休克综合征STSS
  • 变态反应性疾病:风湿热、急性肾小球肾炎

G+!常见化脓性球菌,广泛分布
血平板溶血现象分类

  1. 甲型溶血性链球菌:1~2 mm溶血环,草绿色溶血环,α溶血
  2. 乙型溶血性链球菌:2~4 mm,界限分明、完全透明溶血环,β溶血
  3. <u>丙型链球菌</u>:无溶血环、不产溶血素,一般不致病。

(一)化脓性链球菌

  1. 采取标本
    急性期,抗生素之前最佳
    冷藏运送,1天内、最好<2天
  2. 病原分离
    含5%脱纤维羊血的胰酶消化大豆琼脂(TSA)培养基,增菌用THB肉汤
    脓液、咽拭子直接血琼脂平板,血液、脑脊液先增菌→划种血琼脂平板
    35~37℃,24 h,灰白色、透明or不透明、有乳光、圆形突起小菌落
    显微镜下链状排列,液体培养基中形成长链,48 h、可提高检出率
  3. 病原鉴定
  4. 杆菌肽敏感试验:95%A群链球菌对杆菌肽非常敏感、抑菌环>10 mm,血琼脂平板、肉汤培养物涂抹
  5. CAMP试验:血平板上B群链球菌、产生CAMP因子,促进金葡菌β溶血素活性。
    B群鉴定指标!血平板上、金葡菌直线,待检菌垂直平分线,35℃过夜,矢形(半月形)加强溶血区,CAMP+
  6. 马尿酸钠水解试验:B群具马尿酸钠水解酶。接种于马尿酸钠培养基,35℃48 h,离心上清液+FeCl3试剂,恒定沉淀+ →推断为B群
  7. 七叶苷水解试验:D群链球菌水解七叶苷,生成葡萄糖+七叶素,七叶素+枸缘酸铁Fe2+→黑色沉淀物。接种于七叶苷培养基,35℃过夜,变黑+
  8. 6.5%NaCl生长试验:D群链球菌耐盐能力强,接种6.5%NaCl琼脂培养基,35℃过夜,长菌落&变黄!+,不长-
  9. 血清学试验:细胞壁的多糖抗原不同,ABCD等20群,Lancefield分群,致病链球菌90%为A群(杆菌肽)
  10. 快速检测方法
  11. 酶标免疫测定法:A群,咽拭子,10分钟鉴定是否A群
  12. 聚合酶链反应:特异扩增A群的致热外毒素A、B、C基因speA、speB、speC;溶血素O基因slo
  13. 抗体检测
    常用抗体为“抗溶血素O”ASO。溶血法&乳胶凝集法,主要用于辅助诊断风湿热&肾小球肾炎

(二)肺炎链球菌(G+!有荚膜!矛头状肺炎双球菌--奥普托欣试验、胆汁溶菌试验、菊糖发酵试验)

机体内形成荚膜(<u>☆荚膜肿胀试验</u>)
兼性厌氧、<u>营养要求高</u>、培养基需含血液or血清
37.5℃、pH7.4~7.8、初次培养需CO2孵箱。血琼脂平板上细小、灰色、有光泽扁平菌落,草绿色α溶血环

  1. 采取标本
    根据病种:痰、脓、血液or脑脊液
  2. 镜检
    痰、脓、脑脊液沉淀物→涂片革兰染色,典型G+、具有荚膜的矛头状双球菌
  3. 病原分离
    直接画线接种血琼脂平板,37℃、24 h,挑取α溶血可疑菌落做鉴定,脑脊液和血液需先血清肉汤增菌。
  4. 病原鉴定
    肺炎链球菌主要与(甲型溶血性链球菌)鉴别
    <u>奥普托欣试验、胆汁溶菌试验、菊糖发酵试验</u> 最常用。
  5. 奥普托欣试验:可疑α溶血性菌落涂于血琼脂平板,直径6mm“P”纸片or奥普托欣纸片中央→CO2孵箱or烛缸、35℃、18~24 h→>14mm生长抑制区带为+、α溶血菌株是肺炎链球菌。无生长抑制区带的→产毒性链球菌。9~13mm生长抑制区带→胆汁溶菌试验
  6. 胆汁溶菌试验(平板法也可,新鲜平板,10%脱氧胆酸钠1滴,15 mins):菌株悬于0.5ml盐水,0.5麦氏单位密度标准→分2份0.25ml,+0.25ml盐水/2%脱氧胆酸(胆盐)→轻摇后35~37℃、2 h→(细胞裂解)管液清澈or浊度消失为+,肺炎链球菌。

(三)猪链球菌

35个血清型,最常见2型(R群)、1型,7型、9型也致病。

  1. 采取标本
    血液、脑脊液、腹水、实质脏器→直接涂片、革兰染色→G+球菌
  2. 病原分离
    直接涂布新鲜羊血琼脂平板分离,脑心培养基or血培养瓶增菌。
    选择性培养(15μg/ml多粘菌素B,30μg/ml萘啶酮酸的脑心培养基)增菌→新鲜羊血琼脂平板、37℃、烛缸or 5%CO2、24~72 h→α溶血的可疑菌落涂片&革兰染色→G+球菌
  3. 病原鉴定
  4. 生长特性:10℃、45℃、6.5%NaCl、pH 9.6、麦康凯培养基条件下不生长
  5. 生化试验:V-P(-)、马尿酸盐(-)、乳糖(+)、葡萄糖(+)、淀粉(+)等。。。。
  6. 深入鉴定
    PCR特异基因等

十、钩端螺旋体(钩体、钩体病,G-、人兽共患病,Korthof、EMJH培养基、显微凝集试验MAT)

钩端螺旋体下有2个种:

  • 问号钩端螺旋体(致病性)
  • 双曲钩端螺旋体(非致病性)

G-、酸碱敏感pH 7.27.5、2830℃、需氧or微需氧,生长慢
由柱形原生质体、内鞭毛(轴丝)、外膜组成。

  1. 采取标本
    血液、脑脊液→抗凝剂试管(不可用枸橼酸钠-抑制钩体生长)<u>5~20℃</u>保存、一周内接种培养基。
    尿症期→中段尿液→1%牛血清白蛋白将尿液稀释10倍→5~20℃保存数日
    眼部并发症→眼房水
    羊水,地表水、死亡数小时内→内脏or骨髓
  2. 病原分离
    血液中含生长抑制物,1~2滴血液or0.5ml脑脊液接种到5ml培养基(<u>Korthof</u>、EMJH培养基)2管
    尿液→磷酸盐缓冲液1:10、1:100稀释→取50μl接种5ml培养基(加入新霉素滤纸片or5-氟尿嘧啶)
    器官组织:肾皮质小米粒组织块-研碎
    环境水样:3ml注射豚鼠腹腔,4 h取心血培养,4 weeks取血液、肾、脑培养&血清学试验。
    室温(20~30℃)培养所有标本、暗视野显微镜、1滴培养物、每周查一次、5周。每月查2次、4个月→阴性。
    阳性通常1~2周培养:培养液透明、轻度乳光、摇动-云雾状浑浊,镜下运动活泼、1端or2端有钩
  3. 病原鉴定
  4. 钩体血清“群”鉴定:显微凝集试验MAT,兔免疫血清、PBS倍比稀释1:20~1:3200、96孔板、每孔50μl菌悬液、37℃2 h、暗视野显微镜、50%菌体凝集的最大稀释度为“凝集滴度”。
    血清型水平→交叉凝集吸取试验、参考实验室
  5. 钩端螺旋体鉴定:分子生物学技术
  6. 抗体检测
  7. 收集标本:急性期、恢复期双份血清,56℃水浴30 mins灭活。间隔1周
  8. 抗原制备:国内15群15型钩体参考株接种培养基,2830℃培养57 d,≥50条/高倍视野(400×),运动活泼无自凝。
  9. 血清盐水稀释,50μl,96孔板,参考株钩体活菌,37℃孵育2 h。50%菌体凝集→最大稀释度、凝集滴度,4倍↑-诊断意义。

十一、莱姆病原(1985年我国发现。BSK培养基、蜱、鼠-宿主、发酵代谢产物--<u>乳酸</u>,与梅毒、钩端螺旋体不同)

伯道疏螺旋体:左旋、10~40μm、(表层、外膜、鞭毛、原生质柱)、BSK培养基
G-、发酵代谢产物--乳酸,与梅毒、钩端螺旋体不同
☆1985年我国发现

  1. 采取标本
    血液、尿液、脑脊液
    传播媒介,鼠是主要“宿主”,采取标本。
    -20~4℃运送
  2. 镜检
    蜱中“肠”,鼠、病人组织制成悬液,暗视野显微镜直接检查。
    涂片→组织学染色、特异直接荧光抗体染色→用于动物调查、病人快速诊断(检出率低)
  3. 病原分离
    鼠类组织、蜱中肠、病人血0.2~0.5ml,红斑周围皮肤组织→接种BSK培养基、33℃培养,每周暗视野显微镜检查1次,及时传代。1个月后阴性则盲传一代。
  4. 病原鉴定(需要荧光显微镜
    间接IFA鉴定:兔抗B31特异性多克隆抗体or莱姆病特异单克隆抗体(4倍↑or≥1:256诊断)
    PCR基因分型--if致病基因型
  5. 尿液检测
    PCR尿液特异DNA片段
  6. 抗体检测
    ELISA、IFA(4倍↑or≥1:256诊断)、WB(最终确诊方法)

十二、布鲁氏菌(肝浸膏琼脂培养基、噬菌体裂解Tb、血清试管凝集试验SAT、虎红平板凝集实验RBPT、乳环凝集实验)

一组球状、球杆状、短杆状细菌 ,无鞭毛、无芽孢。光滑型有荚膜,G-
专性需氧,37℃、pH6.66.8,部分初次分离需5%10%CO2,高营养、生长慢、48 h微小、无色、透明、凸起、光滑型菌落,无溶血。
布鲁氏菌属、6个种19个生物型:羊种13,牛种17,猪种1~5,犬种,绵羊附睾种,沙林鼠种。

  1. 采取标本
    血、组织→双相培养基?。血→注入培养管
    血清凝集试验
  2. 病原分离
    肝浸膏琼脂培养基、商品布鲁司琼脂、布鲁司肉汤、土豆浸液琼脂、蛋白胨琼脂
    生物分离方法,1ml注入豚鼠体内。
    镜检可排除非布鲁氏菌,但不能鉴定布鲁氏菌!
  3. 病原鉴定
    分离到纯种菌株后进行:阳性血清玻片凝集、A、M因子血清凝集、培养的CO2需要&H2S的产生
  4. 深入鉴定
    噬菌体裂解,常用Tb、Wb、Iz、Fi等噬菌体(要求参考菌株对照)
    也可单独使用Tb噬菌体的RTD&10^4RTD裂解实验。
    染料抑菌实验:纸片法&培养基稀释法
    参考PCR实验
  5. 抗体检测
    血清试管凝集试验SAT(1:100++以上),须排除共同抗原微生物的交叉反应
    虎红平板凝集实验RBPT(一定时间内裸目看到)、补体结合试验CFT(1:10++)、抗球蛋白试验(1:100++)、免疫荧光试验IFT、2-巯基乙醇2-ME、半胱氨酸凝集试验CAT、ELISA
    动物鲜乳→乳环凝集实验(<u>布鲁氏菌乳环抗原</u>)

十三、炭疽病原(大质粒pXO1、小质粒pXO2、毛玻璃样、狮鬃样菌落)

炭疽芽孢杆菌。有芽孢、有荚膜、产外毒素
毒素基因位于(大质粒pXO1)荚膜基因(小质粒pXO2)致病所必需,缺少使毒力减弱or消失
土壤中存活数十年

  1. 采取标本
  2. 皮肤:溃疡周围采渗出液;肠型:采粪便;肺型:痰液or咽拭子;
    血液标本都要采
  3. 牲畜:血液&脏器,特别注意‘腔道流出的血",穿刺采取-避免扩大污染
  4. 特别注意动物地点土壤标本,动物制品-生理盐水浸取or拭子涂抹取样
  5. 镜检(特别重要)
    首先涂片,革兰&荚膜染色:大量、均一的两端平齐G+的巨大杆菌→临床诊断
    荚膜染色:菌体周围明显荚膜,诊断+1
  6. 病原分离
    沸水浴20mins后接种。可使用普通、血琼脂、选择性培养基。
    营养需求低,普通培养基上生长良好。菌落灰白色、表面干燥呈“毛玻璃”样,稍隆起。
    镜下菌落边缘卷发样条索纹理→“狮鬃”样菌落
  7. 病原鉴定
  8. 溶血特征:血平板上不出现溶血环!
  9. 显微镜检查:G+粗大杆菌、无鞭毛、棒状、两端截平,人工培育:竹节状长链。芽孢-菌体中央。
    荚膜:美兰染色--淡蓝色荚膜,墨汁负染色--荚膜明显轮廓。
  10. 青霉素敏感试验&串珠试验:10 IU/ml青霉素溶液滤纸片、37℃8~10 h→明显抑菌带。“琼脂片、载玻片上、接种待检菌、青霉素滤纸条、37℃3~4 h”→临界处、荚膜肿胀的串珠状菌链。
  11. 噬菌体裂解试验:AP631株--炭疽噬菌体我国选育,形成透明噬菌斑
  12. 毒力鉴定
  13. 质粒电泳图谱分析:分离获得的菌株→提取质粒→电泳分析→确定2个质粒存在→判断毒力完整
  14. PCR扩增:最常用手段
  15. 抗体检测
    缺乏本底抗体水平资料,双份血清滴度4倍↑,才能诊断。

十四、斑疹伤寒病原--细胞内寄生(普氏、莫氏、姬姆尼次or吉姆萨染色、Vero、L929细胞、金标IFA)

流行性(普氏立克次体--体虱)、地方性斑疹伤寒(莫氏立克次体--鼠蚤
革兰染色不易着色,姬姆尼次or吉姆萨染色。多形性:圆形、杆形、哑铃型、链型。
无芽孢&鞭毛、专性细胞内寄生

  1. 标本采集
    血标本2管。
  • 枸缘酸钠抗凝→培养(细胞培养、鸡胚培养、动物接种)
  • 非抗凝--分离血清→抗体检测(采2次),血块→PCR
    体虱、鼠蚤→悬液
    标本-80℃or-160℃保存
  1. 病原分离
    接种动物:取血液接种2只雄豚鼠腹腔2~3 ml,39.5℃↑为特异发热。观察“阴囊红肿”(流行性-、地方性+)一只豚鼠-心血or脏器→10%SPG悬液→传代,另一只恢复期血清抗体试验。
    病人发热期血液0.5 ml→接种7日龄鸡胚→死亡后48~72 h卵黄囊染色镜检
    细胞培养法:Vero、L929细胞。病人抗凝血or白细胞层→接种单层细胞→观察细胞脱落&染色镜检。
  2. 病原鉴定
    分离的立克次体,PCR鉴定
  3. 快速检测
    病人急性期血液--血凝块→研磨、提取DNA→PCR
  4. 抗体检测
    WHO金标方法:间接免疫荧光IFA
    血清倍比稀释→斑疹伤寒特异抗原的载玻片孔内→高倍镜or油镜观察,荧光强度以阳对为标准→最高稀释倍数为血清抗体效价。
    IgG 4倍↑ 诊断,单份IgG≥1:160现症诊断。

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